기기분석 15장 분자발광분광법

 

15장 분자발광분광법

 

15A 형광 및 인광 이론

(장점) 좋은 감도, 흡수분광법보다 10-1000배더 좋다

선형 농도 측정 범위가 넓다.

(단점) 흡수법만큼 정량분석에 응용되지 않음 화학종들이 UV/Vis 영역에서 광발광 나타내는 수가 적으므로)

감도가 너무 좋아서 발광법으로 정량분석시 시료 matrix로부터 방해받기 쉽다.

- resonance radiation or resonance fluorescence

흡수한 파장을 변화시키지 않고 그대로 재방출하는 형광

원자는 받은 에너지 그대로 내보냄

분자는 들뜨게 하는 에너지 보다 이온될 때 내보내는 에너지가 진동, 회전 등으로 인해 더 작다

15A – 1 형광, 인광 내는 들뜬 상태

- 전자스핀

반자기성: 스핀이 짝지어져 있어 알짜 전기장 갖지 않음, static 자기장에서 인력, 반발력 작용하지 않음

상자기성: 자유라디칼은 unpaired electron 가져서 자기장에 끌린다. 자기moment가짐

- Singlet/Triplet Excited States

Excited Singlet States: 분자에 있는 전자쌍 중 전자 하나가 보다 높은 에너지 준위로 들떴을 때 전자 스핀 바닥상태처럼 짝지어짐 10-5 to 10-8

Excited Triplet States: 2개의 전자스핀이 평행하게 존재, singlet보다 더 에너지 준위 더 작음, 10의 -4승~ 수초로 더 오래 들떠있다.

1) 스핀모양 2)에너지 준위 3) lifetime

 

- 에너지 레벨 다이어그램

forbidden transition So -> S1, S2는 가능하나 T1으로는 불가능

SMALL

15A – 3 비활성화 과정

1) 빛으로 내어놓은 과정 (형광, 인광)

2) 빛으로 내어놓지 않은 과정

형광이 Radiationless과정보다 빠르면 형광 나타남

- Vibrational Relaxation

들뜬 화학종 분자와 용매분자 간 충동로 빠른 에너지 전이 유발 -> 용매 온도 약간 증가

진동으로 들뜬 분자 수명 10-12s 으로 들뜬 전자상태의 가장 낮은 진동전위로 전이

 

- Internal Conversion

빛 방출하지 않고 더 낮은 에너지준위로 전이하는 분자내부 과정

형광보다 더 잘 일어남

Qinine 들뜸파장2개이다. 형광파장은 450nm

Aliphatic compounds 형광보기 어렵다

n Predissociaton: 진동 에너지 너무 커서 결합 끊음, Internal Conversion일어남

n Dissociatoin : 들뜸에너지가 너무 커서 결합 깸, Internal Conversion 일어나지 않음

 

- External Conversion

들뜬 분자와 용매 or 다른 용질 간의 상호작용과 에너지 전이

증거 : 형광세기가 용매에 의해 영향 받거나 입자 사이의 충돌 감소시키는 조건(낮은 온도, 높은 점도)이 형광 증가시킴

 

- Intersystem Crossing

다른 multiplicity의 전자상태에서 교차가 일어남

the heavy-atom effect: 요오드, 브롬과 같은 무거운 원자 있는 분자에서 스핀과 오비탈 사이 상호작용 증가-> 스핀변화

용액의 산소분자 같은 상자기성 화학종 -> Intersystem Crossing -> 형광감소

 

- 인광

Spin character가 다르므로 셀렉션 룰에 의하여 인광은 잘 일어나지 않고 느리게 일어남

점도 큰 매질, 다만 낮은 온도에서 또는 고체 표면에 흡수된 분자에 의해 인광

 

15A – 4 형광, 인광에 영향 주는 변수

- Quantum Yield

= 발광분자 수 / 들뜬 전체 분자 수

형광 잘 방출할수록 Quantum Yield가 1에 가깝

 

- Transition Types in Fluorescence

250nm이하 자외선 흡수하는 경우 형광 안나옴. Predissociaton, Dissociatoin에 의하여

π*→π and π*→n 나타남 σ*→σ은 안나타남

 

- Quantum Efficiency and Transition Type

1. π→π*가 n→π*인 화합물보다 형광 잘일어남

π→π*가 몰흡광계수가 더 커서 (Transition probability ↑)

2. π, π*수명 짧다.

π, π*의 intersystem crossing 이 덜 일어남 -> n→π*는 인광가능

 

- Fluorescence and Structure

① Aromatic

② Aliphatic, allcylic carbonyl structures or highly conjugated double-bond structures

③ 링 개수 증가할수록 condensed정도 증가할수록 Quantum Yield 증가

④ 간단한 헤테로고리는 형광 내지않음 (s pyridine, furan, thiophene, and pyrrole,)

⑤ Fused 링 구조

헤테로고리 핵에 벤젠고리가 접합되면 몰흡광계수 증가 -> 수명 짧아짐 -> 형광

 

벤젠의 치환

i. 최대 흡수 파장이 이동

ii. 형광 픽 이동

iii. 형광 효율

① 할로젠 치환 -> heavy atom 있으면 intersystem crossing통해 singlet -> triplet

② 진동 에너지가 커서 predissociation

③ 방향족 고리에 카보닐기 치환 -> 카보닐의 산소의 nonbonding -> n→π* 형광감소

 

- Effect of Structural Rigidity

유연성이 높은 분자는 구조적으로 뱅글뱅글 돌면서 vibration으로 인해 형광 효율감소

 

- Temperature and Solvent Effects

① 온도 증가 분자간 충돌횟수 증가 외부전환 증가 Quantum Yield 감소

② 점도 감소 충돌횟수 증가 외부전환 증가 Quantum Yield 감소

③ Heavy atom 가지면 intersystem crossing 증가 형광 감소 Quantum Yield 감소 인광은 증가

 

- Effect of pH on Fluorescence

산성or염기성 고리 치환체 가진 방향족 화합물은 pH영향

아닐린 3개의 공명구조 가져서 들떠있는 상태의 첫번째 excited state 를 더 안정하게 함

 

pH 변화 이용해 산염기 적정의 종말점 검출

1-naphthol-4-sulfonic acid 자외선 영역에서 형광방출되어 눈으로 관찰 불가하나 염기 추가시 ion형태가 되어 형광파장이 가시광선으로 이동 눈으로 관찰

 

- Effect of Concentration on Fluorescence Intensity

형광효율이 농도에 어떤 영향을 미치는가

F = K'(P0 - P)

형광세기 F 는 물질에 조사하는 빛 P0 - P 에 비례한다.

l Inner filter effects

내부에서 걸러냄, 형광체 자기자신이 빛을 너무 많이 흡수

Inner filter effects로 인하여 농도 증가 시 계속해서 형광효율이 증가하지 않고 직선관계 성립하지 않음

Primary absorption: 농도가 높아지면 들어오는 빛은 분자가 너무 많이 흡수해서 더이상 온도와 비례하지 않는다. 앞의 분자들이 빛을 다 흡수 해서 뒤의 분자들은 빛 흡수하지 못해서 직선적인 관계 성립하지 않음

Secondary absorption: 빛 받았다가 내어놓아서 detector까지 도달해야 하는데 내어놓는 빛을 옆의 분자가 다시 흡수해버린다.

농도 높을 때 이런 현상이 많아져서 직선관계 성립하지 않음

 

- Dynamic Quenching (= collisional quenching)

Quenching : 들뜬 화학종으로부터 다른 분자로 비복사 에너지 이동

Quenching cite (불순물, 대부분 산소) 와의 충돌로 Quencher 에게 에너지를 뺏겨서 형광이 나타나지 않음

lifetime바뀐다.

Stern-Volmer equation

존재하지 않는 이미지입니다.

F0: the fluorescence signals in the absence of quencher

F: the fluorescence signals in the presence of quencher

Kq: the Stern-Volmer quenching constant

[Q]: the concentration of the quencher. In the absence of quenching

 

- Other Types of Quenching

- Static Quenching

바닥상태부터 화합물과 Quencher가 만나 착물 형성

Dynamic Quenching과 달리 lifetime바뀌지 않음

- Förster Energy Transfer

들떠있는 분자는 기본적으로 oscillation하는데 인접해있는 분자도 마찬가지로 그 분자에 의해 충분히 oscillation하면

들떠있는 그 분자는 더 이상 진동하지 못하고 바닥상태로, 에너지 받은 분자는 계속 oscillation

거리가 멀어도 energy transfer 가능

Dipole-dipole coupling

들떠있는 분자가 자기가 가진 에너지를 에너지가 필요한 다른 분자에게 주는 것

충돌없이, 바닥상태에서 착물 만들지 않고, oscillation에 의하여

 

- Effect of Dissolved Oxygen

산소분자는 상자기성 성질 paramagnetic -> Intersystem crossing

 

15A - 5. Emission and Excitation Spectra

- Excitation spectrum

Excitation 파장이 변하는 동안 고정된 파장에서 발광세기 측정

흡수스펙트럼과 동일

 

- Fluorescence and phosphorescence spectra

일정한 파장으로 들뜨게 하면서 파장의 함수로 방출세기 기록

Photoluminescence는 더 긴파장에서, excitation wavelength보다

Phosphorescence는 더 긴파장에서 , fluorescence bands.보다

파장 측정은 triplet and singlet states.간의 에너지 차이 측정

 

- Total Luminescence Spectrum

3차원: excitation 파장에 따라 emission 파장이 어떤지 한번에 알 수 있다. (3D)

등고선 : excitation 파장에 따라 emission 세기 알 수 있따. (2D)

 

- Synchronous Spectrum

excitation과 emission 파장이 어떤 영역에서 겹치는지

 

15B 형광 인광 측정 기기

Attenuator 사용

광원의 빛이 그대로 detector에 도달하면 detector가 손실되므로

또한 형광으로 나오는 빛은 세기가 작으므로 비슷한 세기로 만들어주기 위해

존재하지 않는 이미지입니다.

15B-1. Components of Fluorometers and Spectrofluorometers

Sources

Filters and Monochromators

Transducers

Cells and Cell Compartments

 

15B-2. Instrument Designs

- Fluorometers

간단, 싸다, 형광물질 분석, 소형, 충격에 강함 쉽게 사용

흡수 or 간섭 필터로 excitation, emission 빛 파장 제한

 

- Spectrofluorometers

excitation and emission spectra 둘다 제공

excitation and emission spectra에 grating있다.

 

- Spectrofluorometers Based on Array Detectors

한꺼번에 많은 양의 빛 감지. ccd등의 detector

다이노드 배열과 전하-이동장치에 기초

1초에 몇 분의 1이내에 형광스펙트럼 얻음

전체 발광스펙트럼 얻음

transducer는 excitation and emission 빛을 측정하는 2차원의 전하-쌍 장치 (Charged – Coupled Device)

Stack plot

한번에 스캐닝이 가능해서 시간이 짧게 소요

Excitation 을 다르게 주면 세기가 바뀌어도 emission 모양은 바뀌지 않음

불순물이 있을 경우 모양이 바뀌므로 불순물도 확인가능

 

- Phosphorimeters

(1) Pulsed xenon arc lamp

시료에 빛을 번갈아 쪼여주고 적당한 시간이 지난 후 인광세기 측정

시료용액으로부터 나오는 수명 긴 인광과 수명 짧은 형광을 식별하기 위해 측정시간을 지연시킨다 (time delay 가 필요)

(2) Dewar flask with quartz windows

4면이 투명한 quartz cell, 보온병과 비슷, 저온에서 실험

인광측정은 장시간 triple state의 충돌 비활성화를 최소화하기 위하여 단단한 매질 내 액체 질소 온도에서 수행

측정하려는 온도에서 분석성분은 유리나 고체 용매 중 용질로 존재

용매 : 다이에틸 에테르, 펜테인, 에탄올

Lifetime이 기므로 충돌이 많이 일어나 열에너지로 다 쓸 수 있다. 따라서 온도 낮춰서 충돌 줄임(용기로 유리사용, 낮은 온도 견뎌야 하므로)

 

15B-3 Correction and Compensation Schemes

발광세기와 스펙트럼에 영향 줄 수 있는 변수

(i) Source stability

(ii) iSource spectral distribution

(iii) Inner filter effects

(iv) Efficiencies of optical components

(v) Spectral responses of instrument components

 

- Source Compensation

발광기기는 기준광증배관에 대한 광원 세기를 모니터링함으로서 기준 검출기 신호에 대해 시료 발광 신호 비가 연속적으로 얻어짐

è 광원세기의 fluctuations 변동과 drift 보상

è 공간 설계에서 더블-빔(세기 안정성 확인하는데 싱글-빔보다 더 유리)과 시간에 따른 설계 둘다 이용

- Corrected Excitation Spectra

파장별로 제대로 된 에너지를 내놓는가

- Corrected Emission Spectra

15B-4. Instrument Standardization

 

 

15C 광발광법 응용

15C-1. Fluorometric Determination of Inorganic Species

(1) Direct method

무기물에 리간드 넣어 complex 만들어 형광이 나오게끔하여 얼마나 형광이 나오는지 측정

(2) Indirect method

어떤 물질이 형광을 감소시키는 능력 이용해 얼마나 형광 감소하는지

 

- Cations Forming Fluorescing Chelates

상자성의 물질 있으면 singlet -> triplet 으로 intersystem crossing

색깔 없는 물질들은 형광과 uv둘다 측정

Alizarin garnet R can detect Al3+

Alizarin garnet R 는 Al 들어가면 형광을 띰 -> Al detect가능

Al와 F가 complex만들면 형광 사라져서 -> F detect가능

 

15C-5. Lifetime Measurements

(i) collisional deactivation processes

nonradiative 경로 중 충돌에 의해서

(ii) energy transfer rates

(iii) excited-state reactions

(iv) additional selectivity in the analysis of mixtures containing luminescent species.

 

Lifetime measurement approach

(i) Time-domain approach

대부분 광원은 continuous 하여 lifetime 측정이 안된다. lifetime 측정 위해 Pulsed한 빛 사용

기울기에 해당하는 정보로 얼마만큼의 lifetime 갖는가

(ii) Frequency-domain approach

어떤 사인파가 나오는가

Time ------푸리에 변환함수------> Frequency

 

15C-6. Fluorescence Imaging methods

형광분자의 이미지가 아닌 형광분자가 있는 영역에 대한 정보를 얻는다.

칼슘과 형광체가 combine하여 칼슘이 있는 영역을 보여줌

이온농도가 시간에 따라 어떻게 바뀌는지

위치에 대한 정보, signal에 대한 정보

 

 

15D 화학발광

A + B → C* + D

C* → C + hv

 

Attractive features:

i) detector만 있어도 가능, 간단한 기기, 외부 광원 없음

ii) A high sensitivity (ppm ~ ppb)

형광이 없다가 나타나므로 감도 좋다.

 

▪ Luminol 루미놀

아주 짧은 시간동안 형광 낸다.

인광은 아님. 인광은 room temp에서 관찰 불가

​